细胞凋亡靶向小分子药物研发和应用前景浅析 | 附我心目中的细胞凋亡科研大牛榜
撰文 | 紫薯
紫薯是【医药研发社交平台】编辑委员会委员
2017年1月27日
● ● ●
引子
受到雨里的感召，也抱着不忘初心的热情，以多年打酱油和现在旁观者的角度聊一聊小分子在细胞凋亡里的应用前景，顺便以路人甲的个人角度涂鸦一下细胞凋亡研究的大牛榜。
正文
三十几年前兴起的细胞凋亡研究热潮在十几年后达到高峰，虽然以“apoptosis”作为文章标题检索发表的文献数量在超过5千/年后开始缓慢下降，但综合文章标题，关键词和摘要中出现的“apoptosis”数量仍旧在不断攀升，可见细胞凋亡在自己的基础研究大体完成之后，迅速且成功地转入临床医学转化的大潮中。也终于在经过20几年的药物研发努力之后，于2016年结下了第一颗硕果，Abbvie/Roche的Venetoclax（ABT-199），选择性Bcl-2抑制剂被FDA批准上市，这也是第一个获得FDA批准的蛋白蛋白相互作用小分子抑制剂。于此同时，大部分原班做细胞凋亡的人马转人细胞自噬的领域，迅速抬升了细胞自噬的基础研究，也成功推出了细胞自噬的诺奖代言人，日本的科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）。也有很大一部分人转入代谢领域，取得了巨大的成功。如代表人物Craig Thompson。
农历新年马上就要到了，告别争议的“尔尔-22”猴年，满怀期望地以崭新的姿态迎接鸡(吉？)年。从细胞凋亡的角度来看，每个人真的都是几乎以“physically全新的自我”进入新年。人体平均每天有500-700亿细胞通过细胞凋亡的形式清除更新，一年下来，替换的细胞数量差不多正好是一个人全部的细胞总和。正是，新年新人新气象！
细胞凋亡区别于细胞坏死，是有准备，有组织的程序性死亡。打包于无形，消匿于免疫，凋亡联自噬，回收再利用。细胞凋亡的失调与许多不同的疾病联系密切。图中的天平罗列了一些例子。
细胞凋亡主要通过两大途径完成，胞外的受体途径和胞内的线粒体途径。如图示。胞外受体途径主要由TNF，FAS， TRAIL等细胞因子配体与死亡受体结合形成大的DISC聚合体，招募并激活Caspase8和10，进而激活下游的caspase3/7，最终完成细胞凋亡过程。血液细胞主要采用这个途径完成细胞凋亡。TNF抗体在风湿性关节炎等自身免疫领域上的应用创造了许多制药史上的记录，这里就不多啰嗦了。在肿瘤治疗应用方面，FAS因为有极强肝毒性，难以应用。TRAIL始终有着巨大的潜力，却因为没有较好的筛选标记物，离应用也还有很远的路。
这里主要介绍线粒体介导的细胞凋亡途径靶点。
John Reed 与Douglas Green 1998年发在《Science》上的“线粒体与细胞凋亡”综述是引用最高的细胞凋亡文献之一。被引用了9537次[1].
抗肿瘤药物大多都具有引起肿瘤细胞死亡的特性。而超过90%的抗癌药是通过线粒体依赖的细胞凋亡杀死癌细胞的。反推过来，凡是不通过细胞凋亡杀死肿瘤细胞的化合物成药就很困难，选择性和毒性可能过不了关。
调控线粒体最重要的蛋白家族就是Bcl-2蛋白了。人体中发现了27个成员。又可以分为三类。保护线粒体的6个，执行最终线粒体破裂功能的两个，其余几乎都是逆境感受器，用来感受不同的胞内外胁迫信号，包括生长因子的去除、DNA破坏剂、氧化信号、钙离子的过载、病毒感染等等。对于肿瘤应用来说，主要是靶向拮抗细胞凋亡的6个Bcl-2的蛋白，它们也在约超过一半的肿瘤中过量表达，造成化疗、放疗和靶向疗法的抗药性。但对于多数肿瘤，特别是固体瘤中，Bcl-2蛋白可能不是单一的，甚至是主要的致癌驱动因素。这也是早期Bcl-2抑制剂在肺癌的临床试验中失败的主要原因吧。
天然产物中有许多化合物具有抑制Bcl-2蛋白活性的，像茶多酚、棉子酚，藤黄酸、抗霉素等。但这些天然产物成药性，选择性较差，难以成药。高活性且具有较好选择性的Bcl-2抑制剂ABT-737最早由Abbott（后来的Abbvie）的Steven Fesik组于1995年《Nature》上报道[2]。随后具有口服生物活性的类似物ABT-263在体外细胞和动物模型显示良好的活性[3]。ABT-263被迅速推上肺癌的临床试验，结果却令人失望。统计结果看不到疗效。现在看来，当时对用生物标记物选择病人还不是太重视，否则在部分患者中还是应该有效果的。当然，Bcl-2抑制剂也缺少特别有效的选择标记。退而求其次，ABT-263在血癌上表现出良好的活性，但对Bcl-XL的抑制造成了严重的血小板降低等副作用，此时选择性高的Bcl-2抑制剂ABT-199被设计出来，在保留疗效的前提下，大大降低了毒副作用。
但是ABT-199 的临床研发之路也不是一帆风顺的。详情见前文[4]。
ABT-199 在实体瘤上单用效果有限，但Bcl-2小分子抑制剂可能是一个“百搭”靶点，可以与化疗、放疗、靶向疗法联用，潜力巨大。最近，FiercePharma 把它排在2022年 15大最畅销肿瘤药物第14位，销售预期29.1亿美元。
Bcl-2小分子抑制剂不但可以作为抗肿瘤药物用，还可以用于抗衰老！最近吵得很火[5]。道理上好像也说得通，清楚较易死亡的衰老细胞，给年轻的细胞让位。就像拆老房，盖新房，前提当然得有资源，有能力才行。密切关注进展。最近关于喝咖啡可以长寿的报道大热。那个，喝茶也应该可以，茶多酚可以抑制Bcl-2蛋白，发在癌症研究杂志的封面上，治病不足，预防也许有效。喝的时间够长，总是有效的。
Bcl-XL选择性抑制剂的成药前景还不明朗，特别是它有较高的毒副作用（血小板减少症）。
Mcl-1选择性抑制剂经过多年的努力，已经处在突破的边缘。Fesik等在2015年的综述里提到的Mcl-1抑制剂还多处在早期先导化合物的阶段[6]。到了2016，有超过4个研究组已经得到具有低nM的选择性Mcl-1抑制剂包括Fesik组，澳大利亚组的，Abbvie自己的，AZD也在做。其中去年底澳大利亚组在Nature上发表的S63845 [(Ki (Mcl-1, FP) < 1.2 nM; Kd (Mcl-1, SPR) = 0.19 nM)], 对Bcl-2和Bcl-XL都高于10uM] 比Abbvie的A-1210477活性提高了20倍 [7]。文章中提到，S63845能够有效地杀死Mcl-1依赖的细胞，包括多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤细胞。在动物模型上，S63845在多种血癌细胞系中显示出良好的抗肿瘤活性。在实体瘤上与化疗合用，也表现出明显的肿瘤抑制活性。美中不足地是S63845还没有口服生物活性，动物模型试验用地是血管注射。据说，Fesik组的高活性的Mcl-1抑制剂已经有较好的PK和口服生物活性。期望今年4月AACR上见到他们最新的数据。
其它的拮抗凋亡的Bcl-2抑制剂也有报道，比如Bfl-1在淋巴细胞活性调控中起着重要作用，选择性的先导化合物也存在[8]。但其生物学功能与疾病的联系尚不明朗，还不知道将来如何应用。
除了最热门的靶向拮抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白的抑制剂，对于靶向促进细胞凋亡的Bcl-2蛋白家族如Bax，Bid等的药物发现也有一些报道[9]。如早期Medivation 的David Huang就尝试过用具保护线粒体MPTP活性的抗组氨酸抑制剂latrepirdine治疗帕金森。这一大类杂环小分子据说也有Bid蛋白抑制活性。体外细胞模型能够保护神经细胞凋亡，只是有效窗口很窄，这也许是最终latrepirdine三期临床治疗帕金森不成功的主要原因之一。希望将来能找到选择性更好的Bid抑制剂。
接下来就轮到IAP（The Inhibitor of Apoptosis）抑制剂。人体中有7个IAP蛋白家族成员，其中5个与肿瘤直接相关。研究最多的是XIAP, cIAP1, cIAP2。IAP能够通过抑制caspases来抑制细胞凋亡，在许多肿瘤中也过量表达，看起来是个不错的靶点。小分子IAP抑制剂多是模仿从线粒体释放出来的SMAC蛋白末端四个氨基酸，AVPI。各大制药公司多有自己的IAP小分子产品线。最近活跃在一期和二期临床的至少有5个。IAP单用初步的结果不是很乐观，部分患者最好的反应只是病情稳定。IAP小分子抑制剂本身的用量也有些悖论，它既可以通过抑制XIAP，cIAPs等caspase的抑制蛋白来增加肿瘤细胞凋亡的敏感性，同时它又上调NFkB信号通路，促进肿瘤细胞的生长，繁殖和免疫的增加。IAP本身不是一个很强的驱动致癌因素。联用也许是更合理的。同时，IAP临床试验也缺少有效的标记物。看来IAP小分子成药可能是艰难而漫长的。[10]
P53-MDM2的蛋白蛋白相互作用小分子抑制剂传统上也归于细胞凋亡的靶点。P53是所有肿瘤中突变率最高的抑癌基因。突变了的抑癌基因再找回来总是很难。P53-MDM2小分子抑制剂实际上是靶向野生型的P53，被MDM2过量表达下调了的那部分肿瘤。功能万金油的P53 与细胞凋亡的最直接的联系是它可以通过转录水平调高Bax，NOXA，PUMA等促进细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白的表达水平，从而达到杀死突变细胞的目的。P53突变自己也不是一个很强的致癌因素，P53 突变多发生在肿瘤癌变的早期。
当初Roche新泽西Nutley分部费了老大劲从超过百万的小分子化合物库中筛出nutlin系列[11]，成功推上临床，做做停停，至今单用效果仍是不尽人意。Roche新泽西分部后来也被关闭解散了。现在各大制药公司也多有自己的P53-MDM2抑制剂，只是没有太多动力往前推。突破点也许跟IAP抑制剂一样，需要联合用药。比如在AML，ABT-199 单用应答率小于20%，与化疗药物等合用可以大大提高应答率。Roche 也正在计划ABT-199与其P53小分子抑制剂Idasanutlin在AML合用，争取为P53 找到一个突破口。
时事造英雄，细胞凋亡的研究催生了许多科研和转化牛人，这里罗列一下我心目中的大牛榜：（括号中前面数字为发表文章数量，数据来自PubMed。括号中后面数字来自Google Scholar文献引用数据，Google Scholar数据不全，就只计算了前10篇引用率作为估算值。截至日期1-26-2017）
Howard Robert Horvitz (251；>31057) 把Horvitz拿来压阵，毕竟这个是目前唯一获得诺奖的。虽然他文章不算太多，引用也不太高，前10篇是31057次。他在秀丽线虫里克隆研究的细胞凋亡的关键基因，为后来扩展到脊椎和哺乳动物的研究铺平了道路。
Xiaodong Wang (>100；<90496) 发表的文章还要少些，引用却大幅增加。对细胞凋亡的核心凋亡小体apoptosome的研究大多是原创性的。（确切的文章和引用数据太难统计了。）
John C Reed (963; >100769 ) John Reed 应该是细胞凋亡领域最多产的了。整个生物领域比他发文章多的也不多吧。他的前100篇文献被引用了100769次，实在没耐心去统计全部了。Google也没有列出他的全部引用数。他的第30篇文章引用次数还过千。每天早上2-3点就起床工作。拿了全美最多的基金，最高的研究所CEO 工资。到了Roche当研发头，报酬又翻10倍。1995-2005 年间，被Thomson Scientific 评为Doctor of decades，那时文章被引用才23729次。铁人啊。
Guido Kroemer (663; 160428) 文章引用数第一。这个法国人真是个数据刷子，胜在综述文章也巨多。引用前十的文章都是综述。从细胞凋亡研究及时转入细胞自噬和代谢，把握时机能力绝对一流。
Douglas Green (587；119572) 仍然活跃在细胞凋亡的一线，具有深厚的免疫背景，总喜欢穿沙滩T恤，航海旅行，拍电影等等，是最有情趣的。
Stephen Fesik (198；>11653) 插个队，作为前Abbott的VP高管，还能发这么多文章，也是对科研有真爱。前10篇文章引用率也达到11653次，引用最高的就是2005年发表在《Nature》的ABT-737 与Bcl-XL的复合物结构。后来进化为ABT-263和ABT-199。ABT-199 2016年终于获得FDA批准，成为第一个细胞凋亡及蛋白蛋白相互作用的小分子抑制剂。应用前景广阔。别人多数从研究所往工业界跳，Fesik却喜欢从工业界往学术界转。牛人。
Junying Yuan (251; 66737) 许多华人科学家赶上了细胞凋亡研究的大潮。Junying Yuan 最早在Horvitz实验室就做出了帮助Horvitz得诺奖的成果。后来自己也是在caspase领域硕果不断。
Stan Korsmeyer (308；>35542) 最受人尊敬的细胞凋亡科学家之一，得肺癌英年早逝。桃李满天下。前10文章被引用高达35542次。最先阐明Bcl-2蛋白家族之间通过相互作用来调控线粒体细胞凋亡，为后来的Bcl-2蛋白蛋白相互作用小分子抑制剂的开发打下基础。
Craig Thompson (632；137773) 在细胞凋亡领域也很出色，后来爆发在代谢领域。
Yigong Shi (>170；33468) 在阐述IAP与caspase结构方面做出了卓越的成果。
还有很多杰出的细胞凋亡科研牛人，如加拿大的Tak Mak（338），做caspase和IAP的Guy Salvesen（219），BertVogelstein（226），澳大利亚的一大帮厉害角色。
结语
衷心祝愿更多的细胞凋亡靶向药物早日问世，造福患者、家人、朋友！
参考文献：
1. Mitochondria and apoptosis. Green DR, Reed JC. Science. 1998, 28;281(5381):1309-12. Review
2. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Oltersdorf T, et. al. Nature. 2005, 435(7042):677-81.
3. ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor. Tse C, et.al. Cancer Res. 2008, 68(9):3421-8.
4. 艾伯维与罗氏联合开发的靶向药Venetoclax究竟好在哪？浅议Bcl-2靶向药Venetoclax的潜在优越性。医药研发社交平台， 2016年5月23日
5. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Chang J, et al. Nat Med.2016, 22(1):78-83.
6. Small molecule Mcl-1 inhibitors for the treatment of cancer. Belmar J, Fesik SW. Pharmacol Ther. 2015, 145:76-84. Review.
7. The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models. Kotschy A, et al, Nature. 2016, 538(7626):477-482.
8. High-throughput fluorescence polarization assay for chemical library screening against anti-apoptotic Bcl-2 family member Bfl-1. Zhai D, et. al. J Biomol Screen. 2012, 17(3):350-60.
9. Structure-activity relationships by interligand NOE-based design and synthesis of antiapoptotic compounds targeting Bid.Becattini B, et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(33):12602-6.
10. Promises and Challenges of Smac Mimetics as Cancer Therapeutics. Fulda S. Clin Cancer Res. 2015, 21(22):5030-6.
11. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Vassilev LT, et. al. Science. 2004, 303(5659):844-8.
本文独家首发于微信公号《医药研发社交平台》。文中仅代表个人观点。
欢迎个人转发到朋友圈、微信群！
欢迎媒体、自媒体、报刊、杂志等署名作者、出处转载！
作者： 紫薯
出处：【医药研发社交平台】（ID：drugsns）
编辑：Walker 配图：紫薯
欢迎欣赏作者的其它原创文章！
紫薯评论癌症医药研发之原创作品集锦
▼▼▼点击【阅读原文】，欣赏作者的更多原创文章！